在生命科學(xué)研究的廣闊領(lǐng)域中，解析基因?qū)Φ鞍踪|(zhì)功能的調(diào)控機(jī)制及蛋白質(zhì)間的相互作用網(wǎng)絡(luò)是揭開(kāi)生命活動(dòng)本質(zhì)的核心環(huán)節(jié)。酵母單雜交（Yeast One-Hybrid, Y1H）、酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）及酵母三雜交（Yeast Three-Hybrid, Y3H）系統(tǒng)作為該領(lǐng)域的經(jīng)典研究工具，共同構(gòu)成了解析基因調(diào)控與生物分子互作的“利器組合”。
酵母雜交技術(shù)的原理大多基于GAL4轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制，GAL4作為一種酵母轉(zhuǎn)錄因子，其核心功能是激活下游基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。GAL4結(jié)構(gòu)上包含兩個(gè)關(guān)鍵功能域：一是位于N端1-147位氨基酸殘基區(qū)段的DNA結(jié)合域（DNA binding domain，BD），二是位于C端768-881位氨基酸殘基區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域（Activation domain，AD）。其中，BD能夠特異性識(shí)別并結(jié)合基因上游的激活序列UAS（Upstream-activating sequence）；而AD的作用則是啟動(dòng)UAS下游基因的轉(zhuǎn)錄。值得注意的是，BD與AD單獨(dú)存在時(shí)無(wú)法激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，只有當(dāng)二者在空間上實(shí)現(xiàn)充分接近并形成功能復(fù)合體時(shí)，才能共同激活UAS下游的啟動(dòng)子，進(jìn)而促使啟動(dòng)子下游的目標(biāo)基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄。
圖1 轉(zhuǎn)錄因子GAL4
麥克林提供各類(lèi)實(shí)驗(yàn)用酵母雜交試劑，具有純度等級(jí)高、生產(chǎn)工藝先進(jìn)、支持研發(fā)定制等特點(diǎn)，能被廣泛適用于各類(lèi)科研項(xiàng)目、研究實(shí)驗(yàn)中，歡迎選購(gòu)。
本文通過(guò)以下幾點(diǎn)介紹麥克林酵母雜交試劑的化學(xué)特性和相關(guān)應(yīng)用：
1. 酵母雙雜交系統(tǒng)工作原理
2. 酵母單雜交系統(tǒng)工作原理
3. 酵母三雜交系統(tǒng)工作原理
4. 麥克林酵母雜交試劑產(chǎn)品介紹
1. 酵母雙雜交系統(tǒng)工作原理
酵母雙雜交技術(shù)是解析蛋白質(zhì)互作的核心工具，根據(jù)靶標(biāo)蛋白特性分為兩大關(guān)鍵系統(tǒng) —核系統(tǒng)與膜系統(tǒng)。
核系統(tǒng)的工作原理主要基于GAL4的AD與BD作用特性。如圖2a所示，將目標(biāo)蛋白A、B的基因分別克隆至BD、AD載體上，通過(guò)酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)將構(gòu)建好的載體DNA-BD、DNA-AD轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞中，使酵母細(xì)胞表達(dá) A-BD 和 B-AD 融合蛋白。若 A 與 B 蛋白存在相互作用，二者在空間上會(huì)充分接近并形成功能復(fù)合體，可以重構(gòu) GAL4 的完整轉(zhuǎn)錄激活功能，進(jìn)而激活下游報(bào)告基因（如HIS3、ADE2等）的表達(dá)，最終通過(guò)觀察缺陷型培養(yǎng)基上酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)情況或顯色反應(yīng)，確定A、B蛋白是否存在相互作用。
在膜系統(tǒng)酵母雙雜交體系中，由76個(gè)氨基酸殘基組成的泛素蛋白發(fā)揮著重要作用。如圖2b所示，高度保守的泛素被拆分為 C 端 Cub（融合轉(zhuǎn)錄因子 TF）和 N 端 NubG 兩個(gè)無(wú)獨(dú)立功能的片段，將蛋白A、B的基因分別克隆到Cub與Nub的表達(dá)載體上，并將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞，使酵母細(xì)胞分別表達(dá)出A-Cub-TF、B-NubG融合蛋白。當(dāng)?shù)鞍譇與B在細(xì)胞膜上發(fā)生相互作用時(shí)，會(huì)牽引Cub與NubG空間上靠近并重構(gòu)為完整泛素，泛素被泛素特異性蛋白酶（USP）識(shí)別剪切并釋放TF，TF進(jìn)入細(xì)胞核后激活報(bào)告基因的表達(dá)，從而使得該系統(tǒng)可以通過(guò)使用缺素培養(yǎng)基以及菌株是否變藍(lán)進(jìn)行陽(yáng)性互作的篩選。
圖2 酵母雙雜交原理
2. 酵母單雜交系統(tǒng)工作原理
酵母單雜交系統(tǒng)（Yeast One-Hybrid, Y1H）是在酵母雙雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的，與酵母雙雜交相比，其核心差異在于不依賴(lài) DNA 結(jié)合域（BD）的參與，是一種用于研究蛋白質(zhì)與特定 DNA 序列相互作用的技術(shù)。
在 Y1H 實(shí)驗(yàn)體系中，將目標(biāo) DNA 序列（Bait，啟動(dòng)子或增強(qiáng)子片段）整合至酵母細(xì)胞的報(bào)告基因上游區(qū)域；同時(shí)，候選蛋白A與激活結(jié)構(gòu)域（AD）融合后，在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出A-AD融合蛋白。若候選蛋白質(zhì)與目標(biāo) DNA 序列發(fā)生特異性結(jié)合，便會(huì)激活報(bào)告基因表達(dá)，最終通過(guò)觀察缺陷型培養(yǎng)養(yǎng)上酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)情況或顯色反應(yīng)，確定DNA與蛋白間是否存在特異性結(jié)合。
圖3 酵母單雜交原理
3. 酵母三雜交系統(tǒng)工作原理
酵母三雜交系統(tǒng)在酵母雙雜交系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，引入了能夠同時(shí)插入兩個(gè)外源蛋白的pBridge質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)時(shí)將蛋白A與蛋白Bait X的基因同時(shí)構(gòu)建到pBridge質(zhì)粒上，蛋白B基因構(gòu)建到AD質(zhì)粒上，通過(guò)酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞中，通過(guò)缺陷型平板上酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)反映Bait X蛋白對(duì)其他兩種蛋白質(zhì)的作用方式。
酵母三雜交可變性很強(qiáng)，Bait X可以通過(guò)多種方式參與互作：
a) 若蛋白 A 與蛋白 B 不直接相互作用，Bait X 可作為 “橋梁” 促進(jìn)二者互作（如圖 4a）；
b) 通過(guò)修飾其中一個(gè)蛋白，使原本不直接互作的 A、B 產(chǎn)生相互作用（如圖 4b）；
c) 蛋白 A 與蛋白 B 可直接相互作用，Bait X 則可能發(fā)揮抑制作用，導(dǎo)致二者的互作減弱甚至完全終止（如圖 4c）。
圖4 酵母三雜交原理
4. 麥克林酵母雜交試劑產(chǎn)品介紹
麥克林酵母雜交產(chǎn)品線(xiàn)秉持“精準(zhǔn)、高效、便捷”的核心定位，深度聚焦科研場(chǎng)景中的實(shí)際需求，包含酵母培養(yǎng)基、 DO Supplement 系列氨基酸缺失混合物、酵母感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化試劑等，旨在為科研人員提供從載體構(gòu)建、菌株培養(yǎng)到篩選驗(yàn)證的一站式實(shí)驗(yàn)工具。
借助麥克林 DO Supplement 系列氨基酸缺失混合物構(gòu)建營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選體系，并結(jié)合其酵母轉(zhuǎn)染試劑保障載體高效導(dǎo)入，對(duì) Protein A 與 Protein B 的互作關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。如圖5所示，通過(guò)陰性對(duì)照（AD+BD、AD-Protein A+BD、AD+BD-Protein B）排除空載體互作和蛋白自身激活后，AD-Protein A 與 BD-Protein B 的組合在 SD/LTAH 平板上生長(zhǎng)，證明Protein A 和 Protein B 存在相互作用。
圖5 麥克林酵母雙雜交實(shí)測(cè)圖
| 產(chǎn)品編碼 |
產(chǎn)品名稱(chēng) |
規(guī)格 |
價(jià)格 |
| C675439 |
釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化試劑盒 |
50T |
648 |
| D718458 |
變性鮭魚(yú)精DNA（10mg/mL） |
1mL |
271 |
| Y718635 |
酵母質(zhì)粒大量提取試劑盒 |
10T |
561 |
| Y917940 |
酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒 |
50T |
318 |
| Y718603 |
酵母蛋白提取試劑盒（酶法） |
100T |
946 |
| Y718633 |
酵母破壁酶溶液 |
1.25mL |
315 |
| P769007 |
蛋白酶抑制劑混合物(真菌或酵母抽提用,100X) |
1mL |
460 |
| Y766530 |
YNB培養(yǎng)基(無(wú)氨基酸酵母氮源) |
100g |
350 |
| Y875138 |
無(wú)氨基酵母氮源 |
5g |
67 |
| Y718573 |
YPDA培養(yǎng)基 |
250g |
328 |
| D775870 |
DO Supplement -Ura |
20g |
464 |
| D718561 |
DO Supplement -Leu |
20g |
425 |
| D718560 |
DO Supplement -Trp |
20g |
425 |
| D718552 |
DO Supplement -Leu/-Trp |
20g |
425 |
| D718551 |
DO Supplement -Arg/-Ura |
20g |
425 |
| D718549 |
DO Supplement -His/-Met |
20g |
425 |
| D718542 |
DO Supplement -His/-Leu/-Trp |
20g |
425 |
| D718541 |
DO Supplement -Leu/-Lys/-Ura |
20g |
425 |
| D718540 |
DO Supplement -Leu/-Ura/-Val |
20g |
425 |
| D718532 |
DO Supplement -Ade-His-Leu-Trp |
20g |
425 |
| D718525 |
DO Supplement -His/-Leu/-Met/-Ura |
20g |
425 |
| D718523 |
DO Supplement -Leu/-Met/-Trp/-Ura |
20g |
425 |
| D718522 |
DO Supplement -His/-Leu/-Met/-Trp/-Ura |
20g |
425 |
| D718521 |
DO Supplement -His/-Leu/-Lys/-Met/-Ura |
20g |
425 |
| D718520 |
DO Supplement -Cys-His/-Leu/-Met/-Trp/-Ura |
20g |
425 |
| D718516 |
DO Supplement -Ade/-His/-Leu/-Met/-Trp/-Ura |
20g |
425 |
| S675974 |
SD/-Leu/-Trp Broth(液體預(yù)混培養(yǎng)基粉劑) |
10EA |
853 |
| S675964 |
SD/-Leu/-Trp with Agar(固體預(yù)混培養(yǎng)基粉劑) |
10EA |
1065 |
| B885860 |
5-溴-4-氯-3-吲哚基 α-D-吡喃半乳糖苷 |
25mg |
532 |
| A937715 |
Basifungin |
1mg |
481 |
| A800538 |
3-氨基-1,2,4-三唑 |
25g |
34 |
| G930573 |
β-半乳糖苷酶活性測(cè)定試劑盒-酶標(biāo)法 |
100T |
1250 |
| P885746 |
PEG 3350溶液 |
100mL |
216 |
| P885749 |
PEG-TE-乙酸鋰溶液 |
50mL |
179 |
| P885747 |
PEG-乙酸鋰溶液 |
100mL |
158 |
| T885349 |
TE-乙酸鋰溶液 |
25mL |
65 |
| L885226 |
乙酸鋰溶液 |
100mL |
154 |
| R885244 |
無(wú)RNase的TE緩沖液 |
100mL |
234 |
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